305研究室

 呼吸器内科305研究室ではこれまでにも脂質メディエーターの呼吸器疾患における役割や, びまん性汎細気管支炎に関連 する遺伝子の解析などの研究を行ってきました. 最近では高井講師が中心となって,呼吸器疾患を分子生物学の言葉で記述する べく,様々な手法を用いて, 肺癌,びまん性肺疾患の研究を行っています.



最近の研究成果から

siRNAのin vivoでの発現と呼吸器疾患における遺伝子機能解析システム構築
 本研究室ではsiRNAのin vivoでの発現のためにアデノ関連ウイルス(AAV)を用いた短鎖RNA発現システムを構築した [Kage H, et al Exp Lung Res.37(3):175-85, 2011] .これは,Stratagene社のAAV血清型2(AAV-2)のキット,すなわち,アデノウイルスE1A, E1Bで不死化したヒト胎児腎臓細胞にE2A/VA/E4を発現するプラスミド,AAV-2の遺伝子複製酵素(repricase, Rep), カプシドタンパク(Cap)を発現するプラスミド,更にウイルスのinverted terminal repeat(ITR)でプロモータ,目的遺伝子, polyAシグナルを挟んだプラスミドを共感染することで,感染性はあるが複製能のない組み替えウイルスが得られる系, を用いている.また肺の上皮細胞においてはAAV-2とは血清型の異なるAAV-5の方が親和性がよいとされており [Zabner J et al., Journal of Virology 74(8):3852-8, 2000], AAV-2のレプリカーゼとAAV-5のカプシドタンパクを組み合わせたハイブリッドウイルスも報告されている [Hildinger M et al., Journal of Virology 75(13):6199-203, 2001]ことから,AAV-5を単離したNIHのDr. Chiorini [Chiorini JA et al., Journal of Virology 73(2):1309-19, 1999] からAAV-5のカプシドタンパクのDNAを譲り受け,これらの最近の知見を集約したベクターシステムを構築した. この短鎖RNAのin vivo発現システムを用いて,siRNAや特定のmiRNAに対するantagomir [Krutzfeldt J et al., Nature, 438(7068), 685-9, 2005] をマウス肺に導入することで,様々な分子の肺における機能および疾患への関与を解明することが期待できる.

DNAのメチル化の定量およびクラスター解析を用いた肺癌の分類,同時二重癌と肺内転移の鑑別への 応用
 様々な癌や血液疾患での遺伝子の5'端の異常なメチル化は数多く知られており,肺癌でも20を超える遺伝子で肺癌に伴う 異常なDNAメチル化が知られている.p16のような癌抑制遺伝子のメチル化はそれ自体癌細胞の性質を規定している可 能性があるが,カルシトニン,セロトニンの受容体などそれ自体は一見癌化には関係のない様な遺伝子も高率にメチル化が認 められている.これらについては癌化に伴うDNAメチル化の制御の破綻と共に,DNAメチル化の異常が蓄積していることを反映 していると思われる.従って,一部の遺伝子のDNAメチル化の異常は癌細胞の性質を決めており,また,DNAメチル化の異常 の蓄積を評価することで,細胞が癌化してからの”生い立ち”を推し量ることができる.

 メチル化シトシンの検出は制限酵素を用いるものと,bisulfite法の2つ大きく分けられる.前者はCpG配列を認識配列内 に含む制限酵素で,シトシンがメチル化されているとDNAが切れなくなることを利用するものであるが,評価したい配列の中 に制限酵素の認識部位が見あたらないことも多い.一方bisulfite法はシトシンを化学反応によってウラシルに変換する方法で, この反応がメチル化シトシンでは起こらないことを用いることで,反応後のDNAをPCRで増幅し塩基配列を決定したり, プライマー内にCG配列を多く入れて,PCRのかかる・かからないでDNAのメチル化を検出するmethylation specific PCR (MS-PCR) [Herman JG et al, Proc Natl Acad Sci USA 93(18):9821-6, 1996]法などが報告されている.しかし, 20数塩基のプライマーに3,4個のミスマッチがあってもプライマーの配列や 反応温度によってはPCRがかかってしまうので,プライマーによるDNAメチル化の検出には,疑陽性がつきまとう問題があった.
 われわれは,ドイツのグループから報告のあったTaqMan MGBプローブを用いた定量的PCRを用いてDNAのメチル化を定量 する方法 [Zeschnigk M et al., Nucleic Acids Res., 32(16), e125, 2004]を改良し,高感度かつ特異性の高い方法を最近開発し, 報告した [Sano A, et al., Oncogene, 26(45):6518-25, 2007] .本手法はメチル化シトシンの検出にプライマーを用いず,TaqMan MGBという短くかつ特異性の高いPCRプローブを用 いることで,bisulfite法の後のPCR産物におけるメチル化されたDNAとメチル化されていないDNAの比を求めている. この方法では,予備実験として全くメチル化されていない DNAを用いた場合メチル化DNAの信号は検出されず,また1%のメチル化DNAを含む試料でもメチル化DNAを検出すること ができ,特異性かつ定量性のよい方法である.

 この手法を2年間にわたりインフォームド・コンセント取得の後採取された原発性非小細胞肺癌85例,90サンプルの DNAについて応用を行った.10個の遺伝子を用いて解析を行ったところ,DNAメチル化のプロフィールから6つのサブグ ループに分類できた.これらのグループは喫煙者扁平上皮癌から成るグループや,EGFRの突然変異の少ない グループ等各々特徴を持っていた.また,原発巣と転移リンパ節は同じDNAメチル化のプロフィールを示し,1症例で 2つの病変があった症例では,術前の放射線診断で形状から同時二重癌が疑われたが同じメチル化パターンを示した ことから,肺内転移を伴う肺癌との診断に至った症例あるいは病理組織学的には同様な所見を示したものが 異なるDNAメチル化プロフィールを示したことから同時二重癌の診断に至った症例,も含まれている.
 現在本研究で解析した症例の予後調査を行っており,治癒切除例における再発予測のためのシステム構築を行 うと同時に,新たな肺癌特異的なメチルを受ける遺伝子を探索しており,再発の予測や化学療法感受性の予測など に展開するための準備を行っている.

ヒトPIWIタンパクの機能解析,−核内局在とPIWIL4によるp16のクロマチン構造の変化と発現抑制−
多段階の発癌のプロセスにおいて,転写制御の破綻は言うまでもなく重大な役割を果たしている.この中でもエピジェネテ ィクスの異常すなわちヒストンの修飾の異常に始まるクロマチン構造の変化およびDNAメチル化の異常は既に癌組織や細 胞株においてその転写抑制への寄与が明らかになっており,この二つのプロセスのあいだの関係の解明は,癌の治療や予 防において今後きわめて重要になることは疑いの余地がない.申請者らは,ショウジョウバエにおいて生殖細胞形成に関わ る遺伝子として単離されたPIWI遺伝子のヒトホモログ全てをクローニングし,その機能解析を通じてPIWIL4は細胞での強 制発現がDNAメチル化を伴わないH3K9のメチル化というクロマチン構造の変化を介して,癌抑制遺伝子のp16の発現 低下を誘導することを明らかにした [Sugimoto K, et al., Biochem and Biophys Res Commun, 359(3) :497-502, 2007] . この報告を通じてこれまで精巣特異的に発現するとされてきたPIWIファミリータンパクのうち,PIWIL4は精巣以外の組織でも 発現しており,米国のBaylinらのグループの報告にあるように,短鎖RNAによるDNAメチル化を伴わないヒストン修飾および 転写抑制 [Ting AH et al., Nature Gen, 37(8):906-10, 2005]にPIWIL4が寄与しうることを示した.申請者らの報告および Baylinらの報告から,エピジェネティクス異常のうち,ヒストン修飾がDNAの異常なメチル化に先行することは,アカパンカビや シロイヌナズナなどの系では示唆されていたが,ほ乳動物でも同様であることがほぼ確実となった.


プラスミドベクターを用いたテトラサイクリン誘導性siRNAシステムの構築
 2002年のbreakthrough of the yearとして,Science誌の表紙を飾ったように,siRNAは 分子生物学に大きな衝撃を与えた. それまで線虫やショウジョウバエなどの限られた生物で 観測されていたRNA interference(RNA干渉)が,ほ乳類などの高等生 物でも可能である ことが示されたからである.RNA干渉は,発現を抑制したい遺伝子をコードする二重鎖RNA を細胞に導入 することで,従来のノックアウトのように遺伝子の発現を抑制することができる 実験系であるが,ほ乳類の細胞では,長い二重鎖 RNAはウィルスと認識され,導入された 細胞はアポトーシスを起こして死んでしまう.二重鎖RNAを22塩基対程度に短くする ことでこ のアポトーシスを逃れられることが示されたことが,高等生物への応用への道を開いた.
 当研究室の高井は,大学院在籍時より一貫してDNAメチル化とヒト癌,DNAメチル化と転写制御について研究に携わってき たが,米国留学中の2002年に,癌細胞における異常なメ チル化の機構を解明するため,siRNA技術をDNAメチル化酵素 DNMT1に対して応用した. このとき既にプラスミドベクターを用いたsiRNAについて数報の報告があり,価格,導入効率などの 面でプラスミドの方が有利であると判断し,高井らはプラスミドベクターを用いたsiRNA を選択した.このとき併せて,以前発表されたテトラサイクリン感受性のU6プロモータ [Ohkawa J et al. Hum. Gene Ther. 11 577-85(2000)]をヘアピンsiRNAの発現システムに応用した. テトラサイクリン感受性プロモータの下流にDNA methyltransferase 1 (DNMT1)をターゲットとするヘアピン配列を置いた ベクターを構築,これをテトラサイクリンリプ レッサーの発現ベクターと共に,ヒト大腸がん細胞HCT116に導入した.ヘアピン siRNAの誘 導に10μg/mlのドキシサイクリンを用いたところ,ウェスタンブロット上,DNMT1の発現は完全 に抑制された. 興味深いことにDNMT1の発現消失に伴い,細胞の増殖が停止した [Matsukura S, Jones PA and Takai D. Nucleic Acids Research; 31: e77, 2003] .アンチ センスオリゴを用いた他のグル―プも同様の結果を報告し [Milutinovic et al., JBC 278, 14985-95, (2003)], DNMT1が細胞増殖に本質的な役割を果たしていることを示した.また,この結果により標的 遺伝子が細胞の生育, とりわけ増殖に非常に重要な分子である場合,従来の相同組み替 え法では理論上ノックアウトは増殖できず,クローンを 得ることはできないが,本法のようにプラ スミドを導入した細胞を薬剤耐性遺伝子を用いて選択したのち,テトラサイクリンあ るいはドキ シサイクリンを用いて標的遺伝子の発現を抑制することによりその形質を観察可能にするとい うことが示された. 本報告発表後プラスミドの請求,供給は海外を中心に160件余りを数えている.

癌におけるゲノムのメチル化とその異常

 脊椎動物でゲノムを構成する4つの塩基のうちシトシンはメチル化を受けることが知られている.これはCGという塩基配列に 特異的に生じる.メチル化されたシトシンは突然変異によって失われやすく,その結果としてゲノム上で必要不可欠なCG配列のみ が残された.CG配列が多く残っている領域はCpGアイランドと呼ばれ,遺伝子の転写開始点周囲に存在しており,約半数の 遺伝子でCpGアイランドが遺伝子の発現制御に関与している.CpGアイランドのシトシンのメチル化は,周辺のヒストンの化学修飾の 状態を変え,クロマチン構造を変化させる.ゲノムのメチル化,ヒストンの化学修飾などを併せたエピジェネティクスは,塩基配列が 変わっていなくとも,遺伝子の発現パターンを変えて多くの種類の細胞を形成する機構として重要なものと考えられている.また 癌化に伴って,ゲノムのメチル化に異常が起き,癌抑制遺伝子の不活化などにも関わっている.

MS-RDA法の改良およびヒト肺癌におけるセロトニン受容体1Bとエンドセリン1の不活化の同定.

 当研究室の高井らはDNAメチル化感受性のゲノムワイドスキャン法であるMS-RDA法を改良し,ヒト肺癌(扁平上皮癌)細胞株LK-2およびEBC1と扁平上皮癌の発生母地と考えられる正常ヒト気管上皮初代培養細胞に応用し,セロトニン受容体1Bとエンドセリン1のメチル化および発現の低下を明らかにした.これらの異常なメチル化および遺伝子産物の発現低下はヒト非小細胞肺癌の臨床検体でも認められた.

H19プロモーターにおけるCTCF結合部位のメチル化と,ヒト膀胱癌における過小なメチル化

 ヒトのH19IGF2は染色体11p15上に隣接して存在し,互いに異なるアリルから発現する.IGF2は父親由来のアリルから発現し,H19は母親由来のアリルから発現する.ヒトのH19のプロモータ領域にはインシュレータ蛋白CTCFの結合配列が7つある.当研究室の高井らはそのメチル化の状態について検討した.正常胎児組織の解析で7つのCTCF結合部位(CTCF1-7)のうち,CTCF6のみがインプリンティングの維持に用いられていることを示した.これらの領域のメチル化と転写に対する作用を解析するためヒトの第11染色体を1コピーだけもつマウス細胞(ヒト=マウスの体細胞ハイブリッド)を用いた解析を行った.この細胞を脱メチル化剤である5-aza-CdRで処理してから,単一クローンを複数樹立し,クローンにおけるIGF2およびH19の発現を検討したところ,これらのクローンはIGF2あるいはH19のどちらか一方を発現していた.CTCF6のメチル化はH19を発現しているクローンでは脱メチル化されているのに対し,IGF2を発現しているクローンでは,CTCF6はメチル化されていた.さらに,ヒト膀胱癌の検討から,父親由来のアリルが完全な脱メチル化した症例を発見した.これらの結果は,CTCF6領域のメチル化の異常が,H19のインプリンティング状態の破綻に寄与している事を示すものである.


プロモータ構造
 CpGアイランドは5-メチルシトシンをゲノム上に持つ生物において, 遺伝子を予測する上で重要なマーカーの一つである. ’87年にGardiner-Gardenらによって脊 椎動物遺伝子の配列の 解析が行われ,200塩基対以上,GCコンテント50%以上, そして, observed CpG / expec ted CpG (ObsCpG/ExpCpG)0.6以上というCpGアイランドの定義 が提唱された [J. Mol. Biol. 196. 261-282].当研究室の高井はCpGアイランド抽出のためのアルゴリズムを新たに開発し, ヒト第21および22番染色体についてGardiner-Gardenらの定義をみたすCpGアイランドを全て抽出した. この結果から CpGアイランドを定義するパラメータの下限として,長さとして500塩基対以上,GCコンテント 55%以上, ObsCpG/ExpCpG0.65以上とすると,繰り返し配列であるAlu配列が除外 でき,またより遺伝子領域と相関することを示した [Takai D and Jones PA, Proc Natl Acad Sci USA 99(6):3740-5, 2002].本定義はTakai & Jonesの定義と してNCBIでも示されており,ゲノム科学領域でのスタ ンダードとなった.上記報告で用いたCpGアイランド抽出アルゴリズムはグラフィックユーザーイ ンターフェイスから利用できるよう改良し,現在”CpG islands searcher”として,インターネッ ト上で公開している(http://www.uscnorris.com/cpgislands).これまでにこのWebサイトには30,000をこえるデ−タ・サブミッションがあった.

最近の研究予算獲得状況
平成16年度文部科学省特定領域研究(高井)
平成16年度文部科学省若手研究A(高井)
平成16年度喫煙科学研究財団(高井)
2004年度武田科学振興財団医学系研究奨励金(高井)
平成17年度文部科学省若手研究A(高井)
平成17年度喫煙科学研究財団(高井)
平成17年度ライフサイエンス振興財団研究助成金(高井)
平成18年度文部科学省若手研究A(高井)
平成18年度喫煙科学研究財団(高井)
平成18年度文部科学省若手研究B(北川)
平成18年度喫煙科学研究財団(北川)
平成19年度文部科学省若手研究B(北川)
平成19年度喫煙科学研究財団(北川)
平成19年度安田記念医学財団 若手癌研究助成(高井)
平成19年度佐川がん研究助成振興財団(高井)
平成19年度公益信託臨床検査医学研究振興基金(高井)
平成20年度文部科学省萌芽研究(高井)
平成20年度喫煙科学研究財団(高井)
平成20年度文部科学省若手研究B(北川)
平成20年度喫煙科学研究財団(北川)
平成20年度文部科学省若手研究スタートアップ(鹿毛)
平成20年度財団法人黒住医学研究振興財団研究助成金(高井)
2008年度武田科学振興財団医学系研究奨励金(高井)
平成21年度文部科学省挑戦的萌芽研究(高井)
平成21年度喫煙科学研究財団(高井)
平成21年度文部科学省若手研究スタートアップ(鹿毛)
平成21年度財団法人三井生命厚生事業団医学研究助成金(高井)
平成21年度財団法人臨床薬理研究振興財団研究奨励金(高井)
平成22年度喫煙科学研究財団(高井)
平成22年度文部科学省若手研究B(濱野)
平成23年度文部科学省基盤研究B(高井)
平成23年度文部科学省若手研究B(濱野)
平成23年度財団法人三井生命厚生事業団医学研究特別助成金(高井)
2011年度アストラゼネカリサーチグラント(高井)
平成24年度文部科学省基盤研究B(高井)
平成24年度文部科学省挑戦的萌芽研究(高井)
平成24年度文部科学省基盤研究C(濱野)
平成24年度文部科学省研究スタートアップ(川上)
平成24年度文部科学省研究スタートアップ(春原)
平成25年度文部科学省基盤研究B(高井)
平成25年度文部科学省挑戦的萌芽研究(高井)
平成25年度文部科学省若手研究B(川上)
平成25年度文部科学省若手研究B(渡辺)
平成25年度文部科学省研究スタートアップ(春原)

最近の出版論文
Kitagawa H, Watanabe K, Kage H, Inoh S, Goto A, Fukayama M, Nagase T, Ohishi N, Takai D.
Pulmonary Venous Invasion, Determined by Chest Computed Tomographic Scan, as a Potential Early Indicator of Zygomycosis Infection: A Case Series.
J Thorac Imaging. in press
PMID:21912300

Yamauchi H, Motomura N, Chung UI, Sata M, Takai D, Saito A, Ono M, Takamoto S.
Growth-associated hyperphosphatemia in young recipients accelerates aortic allograft calcification in a rat model.
J Thorac Cardiovasc Surg. in press
PMID:22513315

Watanabe K, Emoto N, Hamano E, Sunohara M, Kawakami M,Kage H, Kitano K, Nakajima J, Goto A, Fukayama M, Nagase T, Yatomi Y, Ohishi N, Takai D
Genome structure-based screening identified epigenetically silenced microRNA associated with invasiveness in non-small-cell lung cancer
Int J Cancer 2012; 130(11):2580-90
PMID:21702040

Satoh Y, Mori K, Kitano K, Kitayama J, Yokota H, Sasaki H, Uozaki H, Fukayama M, Seto Y, Nagawa H, Yatomi Y, Takai D.
Analysis for the Combination Expression of CK20, FABP1 and MUC2 is Sensitive for the Prediction of Peritoneal Recurrence in Gastric Cancer.
Jpn J Clin Oncol. 2012; 42(2):148-52
PMID:22172348

Kitano K, Watanabe K, Emoto N, Kage H, Hamano E, Nagase T, Sano A, Murakawa T, Nakajima J, Goto A, Fukayama M, Yatomi Y, Ohishi N, Takai D
CpG island methylation of microRNAs is associated with tumor size and the recurrence of non-small cell lung cancer.
Cancer Sci 2011; 102(12):2126-31
PMID:21917081

Sunohara M, Kawakami M, Kage H, Watanabe K, Emoto N, Nagase T, Ohishi N, Takai D.
Polymerase reaction without primers throughout for the reconstruction of full-length cDNA from products of rapid amplification of cDNA ends (RACE).
Biotechnol Lett 2011; 33(7):1301-7
PMID:21384194

Kage H, Sugimoto K, Sano A, Kitagawa H, Nagase T, Ohishi N, Takai D
Suppression of Tgfβ1 in lung alveolar epithelium-derived cells using adeno-associated virus type 2/5 vectors to carry short hairpin RNA Experimental Lung Research 2011; 37(3):175-85
PMID:21269064

Watanabe K, Emoto N, Sunohara M, Kawakami M, Kage H, Nagase T, Ohishi N, Takai D
Treatment of PCR products with exonuclease I and heat-labile alkaline phosphatase improves the visibility of combined bisulfite restriction analysis.
Biochem Biophys Res Commun 2010; 399(3):422-4
PMID:20674551

Kusakabe M, Watanabe K, Emoto N, Aki N, Kage H, Nagase T, Nakajima J, Yatomi Y, Ohishi N, Takai D.
Impact of DNA demethylation of the G0S2 gene on the transcription of G0S2 in squamous lung cancer cell lines with or without nuclear receptor agonists.
Biochem Biophys Res Commun 2009; 390(4): 1283-7
PMID:19878646

Kusakabe M, Kutomi T, Watanabe K, Emoto N, Aki N, Kage H, Hamano E, Kitagawa H, Nagase T, Sano A, Yoshida Y, Fukami T, Murakawa T, Nakajima J, Takamoto S, Ota S, Fukayama M, Yatomi Y, Ohishi N, Takai D
Identification of G0S2 as a gene frequently methylated in squamous lung cancer by combination of in silico and experimental approaches
Int J Cancer 2010; 126(8): 1895-902
PMID:19816938

Kage H, Kohyama T, Kitagawa H, Takai D, Kanda Y, Ohishi N, Nagase T
Non-infectious bronchiolitis as an early pulmonary complication of hematopoietic stem cell transplantation.
Intern Med. 2008;47(1):61-4.
PMID:18176008

Lin JC, Jeong S, Liang G, Takai D, Fatemi M, Tsai YC, Egger G, Gal-Yam NE and Jones PA
Role of Nucleosomal Occupancy in the Epigenetic Silencing of the MLH1 CpG Island.
Cancer Cell 2007 12(5):432-44.
PMID: 17996647

Sano A, Kage H, Sugimoto K, Kitagawa H, Aki N, Goto A, Fukayama M, Nakajima J, Takamoto S, Nagase T, Yatomi Y, Ohishi N, Takai D.
A second-generation profiling system for quantitative methylation analysis of multiple gene promoters: application to lung cancer
Oncogene 2007 Oct 4;26(45):6518-25.
PMID: 17452971

Sugimoto K, Kage H, Aki N, Sano A, Kitagawa H, Nagase T, Yatomi Y, Ohishi N, Takai D.
The induction of H3K9 methylation by PIWIL4 at the p16Ink4a locus.
Biochem Biophys Res Commun 2007 Aug 3;359(3):497-502.
PMID: 17544373

Saito A, Motomura N, Kakimi K, Ono M, Takai D, Sumida S, Takamoto S.
Cryopreservation does not alter the allogenicity and development of vasculopathy in post-transplant rat aortas.
Cryobiology2006 Apr;52(2):251-60.
PMID: 16442089

Sugimoto K, Makihara T, Saito A, Ohishi N, Nagase T, Takai D.
Betaine improved restriction digestion.
Biochem Biophys Res Commun.2005 Dec 2;337(4):1027-9.
PMID: 16216219

Liang G, Lin JC, Wei V, Yoo C, Cheng JC, Nguyen CT, Weisenberger DJ, Egger G, Takai D, Gonzales FA, Jones PA.
Distinct localization of histone H3 acetylation and H3-K4 methylation to the transcription start sites in the human genome.
Proc Natl Acad Sci USA. 2004 May 11;101(19):7357-62.
PMID: 15123803

Takai D, Nagase T, Shimizu T.
New therapeutic key for cystic fibrosis: a role for lipoxins.
Nat Immunol. 2004 Apr;5(4):357-8.
PMID: 15052263

Takai D, Jones PA.
Origins of bidirectional promoters: computational analyses of intergenic distance in the human genome.
Mol Biol Evol. 2004 Mar;21(3):463-7.
PMID: 14660682

Takai D, Jones PA.
The CpG island searcher: a new WWW resource.
In Silico Biol. 2003;3(3):235-40.
PMID: 12954087

Matsukura S, Jones PA, Takai D.
Establishment of conditional vectors for hairpin siRNA knockdowns.
Nucleic Acids Res. 2003 Aug 1;31(15):e77.
PMID: 12888529

Kaneda A, Takai D, Kaminishi M, Okochi E, Ushijima T.
Methylation-sensitive representational difference analysis and its application to cancer research.
Ann N Y Acad Sci. 2003 Mar;983:131-41.
PMID: 12724218

Takai D, Jones PA.
Comprehensive analysis of CpG islands in human chromosomes 21 and 22.
Proc Natl Acad Sci USA. 2002 Mar 19;99(6):3740-5.
PMID: 11891299

Takai D, Yagi Y, Wakazono K, Ohishi N, Morita Y, Sugimura T, Ushijima T.
Silencing of HTR1B and reduced expression of EDN1 in human lung cancers, revealed by methylation-sensitive representational difference analysis.
Oncogene. 2001 Nov 8;20(51):7505-13.
PMID: 11709722

Takai D, Gonzales FA, Tsai YC, Thayer MJ, Jones PA.
Large scale mapping of methylcytosines in CTCF-binding sites in the human H19 promoter and aberrant hypomethylation in human bladder cancer.
Hum Mol Genet. 2001 Nov 1;10(23):2619-26.
PMID: 11726548

Jones PA, Takai D.
The role of DNA methylation in mammalian epigenetics.
Science. 2001 Aug 10;293(5532):1068-70.
PMID: 11498573